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劃線分離：制備果膠酶劃線培養基，滅菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌種，****次劃線分離培養1-2天后取分離所得單菌落再進行第二次劃線分離，劃線分離的具體方法是：先在平皿上劃定區域，然后將接種針在火焰上進行滅菌操作，取含菌種的培養皿，在火焰上方（注意：不能離火焰太近）打開培養皿蓋，先拿接種針在上蓋處劃線以降溫，然后用接種針輕挑所選菌落一到兩下，將平皿蓋上放好，再取剛剛冷卻了的干凈平皿在1區進行劃線接種操作。操作完畢后對接種針進行滅菌操作，完成后在火焰上方打開平皿蓋，將接種針冷卻后從1區引線到2區，再如圖所示劃線，劃完后引線到3區，同上進行劃線，劃線完畢后蓋蓋平放；

純種保藏：再配制一份普通細菌培養基，分裝試管后滅菌，制得斜面，將純種劃線接種在斜面上培養保存并進行下一步的鑒定。

a) 純種果膠酶水解能力的測定

配制果膠酶篩選培養基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養皿蓋周邊用記號筆做好標記，將分離純化的細菌點種于平板上（注意：點種的量不宜過多，以3～4個為宜），在30℃培養箱中培養1～2天，取培養后的平皿用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，測量并記錄透明圈的大小

b) 簡單染色步驟

i. 涂片

取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無菌水，用接種環無菌操作將沾有菌的接種環置于載玻片上的無菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多）

ii. 干燥與固定

涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物，固定過程應使載玻片通過火焰2-3次，注意溫度的控制，過熱的溫度會將細菌殺死，溫度以手背感覺微微發燙為標準；

iii. 染色

將載玻片平放于載波片支架上，滴加結晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1.5min

iv. 水洗

傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無色為止；

v. 干燥

用吸水紙吸去多余水分后自然干燥；

vi. 鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌的形態。

c) 革蘭氏染色步驟

i. 涂片

先在載玻片一側用記號筆標記間隔的四個區域，在另一側四個區域的位置分別滴加半滴無菌水。分別取四種活躍生長期菌種（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌和一種自選菌）按常規方法涂片（不宜過厚），用酒精燈按照簡單染色中所述干燥和固定的方法對四種菌進行干燥和固定。

ii. 初染

滴加草酸銨結晶紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗；

iii. 媒染

先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗；

iv. 脫色

先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫色約30s，立即用水沖洗；

v. 復染

先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復染1.5min后水洗；

vi. 鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌。分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對照，來判斷枯草桿菌以及另一種自選菌的染色結果。

d) 芽孢染色步驟

i. 涂片，加熱干燥及固定

在潔凈蓋玻片接近中部兩處分別滴一滴無菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規方法加熱干燥及固定；

ii. 孔雀綠加熱染色

用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開始計時并維持5min，注意加熱時應以有蒸汽微微冒出為宜，過熱或加熱不足均會影響觀察效果，且加熱時在載玻片上隨時補加染液，切勿讓涂片干涸；

iii. 水洗

水洗一定要等載玻片冷卻后進行，否則可能導致載玻片的破裂。具體水洗按常規方法進行；

iv. 復染

用0.5%番紅水溶液復染2min；

v. 水洗并干燥

按常規方法水洗后自然干燥；

vi. 鏡檢

先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調焦，最后加香柏油在油鏡下仔細尋找兩種細菌以及其周圍或內部染成綠色的芽孢。

e) 半固體穿刺法觀察細菌運動性

i. 配制培養基

配制半固體牛肉膏蛋白胨培養基，分裝于4支試管內，110度滅菌20-30分鐘，正立于燒杯中冷卻至室溫；

ii. 在無菌操作臺上右手握接種針,以針挑取菌苔.垂直刺入半固體瓊脂培養的中心直至接近(但勿觸及)試管底,然后循原路退出。如圖所示： 

iii. 接種完成后在30℃條件下培養兩天觀察并判斷其運動性。